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本产品是基于染料法荧光定量PCR原理开发。专门检测兔出血症病毒2型的试剂盒。


兔出血症(Rabbit hemorrhagic disease，ＲHD)是由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)引起的一种具有高度传染性、急性致死性兔病。兔出血症病毒2型(RHDV2)引起的ＲHD主要在欧洲流行，病兔的死亡率高达90%。

1. 一站式，用于不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。
   
2. 根据兔出血症病毒2型的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。
   
3. 基于染料法qRT-PCR检测，灵敏度比常规RT-PCR高10～100倍，可以达到至少1000拷贝/反应。
   
4. 使用一管式qRT-PCR技术，RT和PCR两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。
   
5. 本产品足够50次20μL体系的RT-PCR，只能用于科研，不能用于临床。

组分	规格
2×qRT-PCR缓冲液	500μL
10×qRT-PCR酶混合液	100μL
ROX染料I，50×	20μL
ROX染料II，50×	20μL
荧光PCR专用模板稀释液	1mL
兔出血症病毒2型染料法qRT-PCR引物混合液	100μL
兔出血症病毒2型染料法qRT-PCR阳性对照(1×108拷贝/μL)	50μL

保存：-20℃，有效期一年。


一、稀释阳性对照(以10²～10⁷这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原。

1. 标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同)。
   
2. 在7号管中加入5μL 1×10⁸拷贝/μL的阳性对照(本试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10⁷拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
   
3. 换枪头，在6号管中加入5μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁶拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
   
4. 换枪头，在5号管中加入5μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁵拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品RNA的制备

5. 如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第4号(浓度为1×10⁴拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。
   
6. 用自选方法纯化N+2个样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。可以选购本公司的柱式病毒RNA提取试剂盒，其使用手册可以从本公司网站www.bjbalb.com，通过搜索产品名称或产品货号BTN71001下载。

三、设置RT-PCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

7. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于PCR阳性对照(用第4号阳性对照稀释液做模板)。下面只描述定量分析的步骤，定性分析只是把6个标曲反应缩减成1个，其余不变。
   
8. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加)：
   

   成分	样品管 N+2个	RT-PCR 阴性对照	RT-PCR阳性对照 (2～7管)
   2×qRT-PCR缓冲液	10μL	10μL	各10μL
   兔出血症病毒2型染料法qRT-PCR引物混合液	2μL	2μL	各2μL
   50×ROX(见注)	0.4μL	0.4μL	各0.4μL
   样品制备所得RNA模板(来自于第8步)	5.6μL	-	-
   稀释所得6个阳性对照	-	-	各5.6μL
   10×qRT-PCR酶混合液	2μL	2μL	2μL

   注：
   需使用ROX染料I的机型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。
   需使用ROX染料II的机型：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000。
   不需要使用ROX的机型：Thermal Cycle Dice Real Time System，LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene3000、RotorGene 6000。
   
9. 上机后按下面参数进行RT-PCR(参数可能会因仪器不同而需优化)。
   

   过程	温度	时间
   RT(逆转录)	50℃	30min
   预变性	95℃	10min
   qPCR反应 (40个循环)	95℃	15sec
   	60℃	1min(采集SYBR通道的荧光信号)
   按仪器预设程序进行熔解曲线分析

四、数据处理

10. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于35。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。

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